【ag-ab】科技提供重组蛋白表达纯化和抗体制备全流程标准SOP
我们分享重组蛋白表达纯化，抗体制备修饰以及重组蛋白和抗体在免疫检测中应用的可操作性案例。
一、抗体制备所需的基本要求
启动制备抗体之前,我们需要搞清楚以下七个问题：
1、这个抗体用来做什么实验(ELISA、IHC、Western Blot、IF或者IP等)?（功能性要求）
2、是否已有商品化的抗体可以满足以上功能需求?（便利性要求）
3、抗体需要什么种属来源（兔子、山羊、大鼠或小鼠等）?（抗体属性要求）
4、需要多抗还是单抗?（品质性要求）；
5、已具备的抗原信息或材料（抗原信息或材料：CDS序列，重组质粒，重组蛋白、多肽等）?（可能性要求）；
6、是否可建立抗体质检方法（标准的阳性标本及实施抗体实验验证的标准方法）?（可评价要求）
7、是否具备抗体生产平台及经验?（可行性要求）
第1个要求-功能性要求：
科研人员根据实验需求提出对抗体的功能性要求;对一个抗体功能要求越多，其制备难度也就越大【ag-ab】。
第2个要求-便利性要求:
科研工作者对抗体提出需求,首先应考虑商品化抗体:优质商品化抗体一般都经过多层验证和优化,可以直接购买使用,节约时间。一个抗体很难同时满足几项功能要求，这个时候可以考虑分别选购针对不同功能的抗体；除此之外，还需仔细查看抗体数据信息和实验图片，其实验所采用的标本和方法与自己准备实验的标本越相似越好【ag-ab】。
第3个要求-抗体种属要求:
制备多抗选用最多的是兔子，单抗选用最多的是小鼠，对于抗体需求量较大，比如二抗，一般选择山羊【ag-ab】。对于其他种属要求，除实验设计需求，更多是因为抗原与免疫宿主亲缘关系问题，一般来说亲缘关系越远，免疫原性越好【ag-ab】。
第4个要求-品质性要求：
大部人认为单抗比多抗好,其实也不尽然。单抗的特异性好，对于需要区分鉴定同源性较高的抗原或者对于特异性要求较高时，一般选择单抗；另外单抗性质比较稳定，理化性质均一（所有的抗体都是由相同细胞分泌出来）【ag-ab】。多抗的优点是效价和灵敏度高，其针对一个抗原的多表位；与单抗相比，待检标本中同样的蛋白表达丰度，多抗会有更多抗体分子与抗原结合，信号更强，当然也可能引起非特异性问题【ag-ab】。
第5个要求-可能性要求：
好的抗原是制备优质抗体的前提，在制备抗体之前必须有可能制备出好的抗原。如果已经有抗原，可以直接免疫动物；如果没有抗原需要从其已获得的信息或者材料入手制备抗原：序列信息-基因-重组表达-蛋白纯化-动物免疫。对于同源序列较高的蛋白序列也可以考虑通过设计合成多肽偶联载体制备抗原【ag-ab】。制备抗原的方法都是通过人工合成或者生物反应器得到的“模拟抗原”，与天然抗原还是有一定的差异的。获得天然抗原的办法可以直接从组织或标本中提取蛋白，前提是这个蛋白在标本中表达量大且其理化性质稳定。
第6个要求-可评价要求：
筛选方案和纯化方法对抗体制备至关重要，质检方法决定一个抗体的命运，你用什么筛选方法你就得到什么样的抗体，所以在抗体制备之前必须要保证建立一个科学稳定符合质检要求的抗体制备方法【ag-ab】。
最后一个要求-可行性要求：
制备抗体前必须要拥有制备流程所必须的平台设备以及专业人员，如果实验室以前没有涉猎这块并且以后也不打算建设此类平台，本着“专业人做专业事最节约成本”的原则，抗体制备的整个流程或者部分环节还是委托给专业公司。
二、专业抗体公司基本特点
抗体作为我们科研实验和产品研发中一大利器，大多数非抗体相关研究领域实验室都不具备完整研发平台，通过寻找专业抗体公司合作可能更节约您的科研时间和经费；那么怎么寻找合适的抗体公司合作呢？选择专业抗体公司可以考虑以下几点：
1）有专业技术人员，可以回答您的实验问题，所回答的问题实用接地气，能解决您的实际问题【ag-ab】；
2）有专业平台，制备抗体上下游有比较完善的平台，或者可以提供上下游相关产品技术支持【ag-ab】；
3）商业口碑：身边实验室有没有在此公司合作成功的案例【ag-ab】；
4）“100%保证”或者是“只管做不管效果”的都要慎重【ag-ab】；
5）实验方案:实验方案的设计是否顾及考虑您的项目要求还是只管他们自己的模板报告格式写下去【ag-ab】；
6）是否可以准时交付：生物实验存在特别多的不确定性，所以，如果抗原已经开始免疫，而你发现免疫周期比预期延长，这个时候不要着急，你碰到的可能是负责任的公司，因为，免疫周期长，抗体公司相应成本也会增高【ag-ab】。
7）抗体公司是否有专业流程，一般来说专业公司为了指导客户更好的使用服务，多年沉淀积累，一般会有拿得出手的技术手册（非纯商业广告的那种）【ag-ab】。
三、抗体制备的基本原则
抗体制备最为重要的三个原则：适量原则、时间原则和成本原则。
1.适量原则:
根据抗原可获取的难易程度和实际实验抗体需求量来决定制备抗体的量，小鼠一个免疫周期只要200-400ug抗原，一只兔子至少要2mg，而往往高纯度抗原获取的成本都比较高【ag-ab】。对于科研来说，能选择小动物就不要选择大动物，小动物的抗体产量足以满足需求；鉴于动物本身个体的差异性，免疫一只兔子的抗原可以免疫4-5只小鼠，这样可以有效避免动物个体差异或动物意外死亡所造的时间成本浪费。但是我们同时也要考虑，抗体效价问题，一般来说，大动物免疫效价确实比小动物要好；所以作为多克隆抗体制备，首选兔子【ag-ab】。
2.时间原则:
您的下游实验对抗体品质的要求也决定了抗体生产周期和成本；如果抗体用于下游产品开发或者高难度实验，这个就需要从长计议；如果仅仅是为了解决实验应急问题（毕业论文或者文章修回补充数据或实验设计方案变更等应急问题），这个可以启动快速制备流程【ag-ab】；对于免疫原性较好、纯度较高的抗原，可以使用抗体快速制备方案；目前，商业化抗体制备公司推出快速抗体制备服务，主要依赖于水溶性快速佐剂。但是，我们不太推荐快速制备方案【ag-ab】。
3.成本原则：
对抗体品质要求越高，抗体制备成本也会越高；我们可以看到著名商业化抗体网站和说明书上对抗体应用描述中会有抗体的应用范围，应用范围越广，其制备难度可能就越大，这就是抗体行业所谓的“几项全能”；所以，我们在制备的时候够用原则为主。性能比较高的抗体从抗原设计、动物免疫和抗体纯化等环节都会有较高要求，甚至几套方案同时设计，同时实施【ag-ab】。一般我们对此类抗体制备通常会建议两套方案同时进行：多肽方案和重组蛋白方案：对于多肽方案，我们一般会设计三条多肽作为抗原；对于重组蛋白方案，我们一般会至少优选优势表位200aa以上进行重组蛋白表达制备抗原，【ag-ab】80%的项目案例选择400-500aa更为合适。高品质抗体的动物免疫需要密切监测免疫效价动态变化，及时做出调整。高品质抗体的纯化，我们首推抗原特异性纯化，这种纯化方式得到的抗体特异性好，但是产量偏低，一般一只兔子只能得到1-2mg抗体，这个产量对于大部分科研用户来说那已经绰绰有余了【ag-ab】。
四、作为抗原需要具备的属性
抗体制备方案的核心是抗原制备，好的抗原是制备优质抗体的前提，作为抗原需要具备以下几个基本属性：
１.分子量大
大分子物质能长时间留在机体内，有更多机会和免疫细胞（主要是巨噬细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞）接触，引起免疫细胞作出免疫反应（佐剂最主要的作用就是油状物质包裹抗原在体内缓释，形成长期持续刺激）；而对于小分子物质，体内代谢很快将其排出体外，没有机会与免疫细胞接触；同理，即使是大分子物质，如果太容易降解的也不适合做抗原【ag-ab】。小于4kD的蛋白很难激发细胞产生抗体的原因，一反面是因为其容易被排出机体；另外一方面平均每5-10kD的蛋白才有一个抗原表位也就是抗原决定簇（epitope），按照平均值几率来说，分子量太小的抗原很难有有效表位（人工设计表位除外）【ag-ab】。
2.外源性强
个体发育的早期，机体对自身物质形成免疫耐受，与机体物质相似度很高的物质一般不会引起机体产生免疫反应，只有异源性的物质侵入体内，机体才能迅速对抗外来物质的侵害，保护自身；但是机体对有些部分如大脑，眼球，睾丸等物质成分不会产生免疫耐受，但此区域有天然屏障，成为免疫赦免区，如果以此类物质作为抗原可以不考虑免疫耐受和外源性问题【ag-ab】。
3.结构复杂
外源性只是从归类宏观角度上论述抗原性问题，实际上从微观上来说，作为抗原的分子物质的结构必须尽可能复杂，简单重复的序列或者直链物质（比如：糖、氨基酸）组成的序列一般抗原性都很弱，这类物质比如明胶、淀粉、核酸和多聚氨基酸等【ag-ab】。
4.降解性好
作为抗原，必须是可以降解才能抗原提呈；这个似乎听起来有点矛盾，我们通常都喜欢蛋白或者抗原比较稳定，的确如此，那是相对于体外保存而言。塑料、钢铁等难降解的物质免疫原很弱；D-型氨基酸组成的物质免疫原性也都非常弱，因为机体不能降解D-氨基酸组成的蛋白或多肽【ag-ab】。
五、常用抗原类型及制备方法
1.天然提纯抗原
天然蛋白是一种非常好的抗原，主要从机体提取纯化得到,的天然抗原（主要是蛋白质）保持了抗原本身结构（自身修饰，正确构象）特点；但是天然蛋白抗原的纯化难度比较大，并且只有表达丰度较高、性质稳定的天然蛋白才具备可纯化条件，其做抗原制备的抗体，一般适合于ELISA、免疫层析和免疫比浊等类诊断开发类抗体的制备【ag-ab】。
2.重组蛋白抗原
重组蛋白抗原制备常用的有原核表达系统、酵母表达系统、真核表达系统，真核表达系统主要有昆虫细胞-杆状病毒表达和哺乳动物细胞表达系统等。重组表达制备抗原一般会在蛋白序列加上一段用于纯化的标签,除了便于纯化还可以增加蛋白的可溶性和分子量更利于抗体制备，常用的标签主要有GST、6*His、Myc、MBP、Flag、Fc等。根据下游实验对蛋白质的使用需求，如有需要可以切除标签；如不切除，后期抗体在使用时如遇标签抗体干扰，可先用标签蛋白免疫吸附去除高免血清中针对标签的抗体【ag-ab】。重组蛋白与天然蛋白相比，在构象、修饰和蛋白活性上还是有差距的，真核与原核相比，更接近于天然蛋白；这类抗原制备一般适合于Western Blot、IHC、ELISA以及免疫层析、胶体金和免疫比浊等诊断类抗体的制备，只不过制备的过程需要用含内源性蛋白标本进一步筛选验证。
科研用途的抗体，对其品质要求要远远低于诊断用途的抗体，在抗原全长表达遇到瓶颈的时候，可以考虑选取抗原表位性和特异性较强区段进行分段表达尝试，分段选取的技术方案需要专业人员根据方方面面情况综合考虑，初学者往往不得门而入；福因德技术团队在整合大量案例数据和项目经验的基础上，将会不定期与科研工作者分享这方面的经验【ag-ab】。
抗原制备最为重要的环节就是抗原的纯化，通过重组蛋白制备抗原当然也不例外，在项目开始之前这个难度往往被忽视，科研人员往往认为既然在抗原设计的时候融合了纯化标签，纯化过程按照标准流程操作，得到高纯度抗原就是水到渠成，然而结果往往不如人意；诸如，明明带了标签的蛋白挂不上纯化柱子、洗脱下来的蛋白杂带比目的带还多、目的蛋白结合在柱子上洗脱不下来等等。蛋白纯化在业界都是一大难题，一个蛋白的纯化往往会用到几种方案和策略【ag-ab】。根据我们的经验，纯化出一个符合抗体制备要求的重组抗原蛋白至少要用2-3种手段，常用的手段有离子交换层析、标签亲和层析、凝胶过滤分离层析等等【ag-ab】。
3.多肽抗原
多肽抗原需要通过化学合成来实现（多肽的合成是现代化工上是一个比较成熟的技术，可委托专业化的公司来合成就可以了），合成抗原再偶联到蛋白质载体上才能形成大分子抗原，即完全抗原。常用的蛋白质载体主要有BSA（牛血清白蛋白）、RSA(兔血清白蛋白)、HSA（人血清白蛋白）、OVA（卵清蛋白）、GST（谷胱甘肽S转移酶）、KLH（Knoweyhole Limpet Hemocyanin，钥孔戚血蓝蛋白）、MAP（多价抗原肽，主要指多聚Lys）【ag-ab】。对于多肽来说偶联到载体上很容易，多肽链上的羧基/氨基通过EDC（碳二亚胺）或EDC/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)联用将多肽偶联到载体上。如果希望实现定向连接，在多肽合成时，N-端或C-端加上一个-SH(Cys)，通过Sulfo-SMCC试剂偶联到蛋白质载体上【ag-ab】。
多肽抗原偶联到载体上一般要求多肽分子与载体分子偶联摩尔比要达到10:1～20:1【ag-ab】。
多肽抗原与天然抗原或重组蛋白比较的优势在于抗原表位优势富集，更好刺激机体产生抗体【ag-ab】。人工合成多肽制备抗原主要应用于抗原难以提取，或难于通过重组表达来实现的，或者蛋白抗原本身与机体内其他蛋白同源性过高的抗体制备【ag-ab】。
多肽作为抗原主要难点在于多肽序列的设计（抗原表位的选取）。专业化的多肽设计团队基于生物信息学的数据库，采用先进的分子对接算法，借助高性能服务器，可以实现百万级多肽的筛选，筛选周期仅需一周。
4.小分子抗原
小分子抗原是指小分子化合物，分子量一般都比较小；通常来说，分子量越大、结构越复杂越容易制备高亲和力的抗体，含有芳香环的小分子更容易引起免疫反应。同样，小分子化合物必须与载体蛋白偶联才能形成完全抗原作为免疫原，小分子化合物与载体偶联一般需要借助于中间体途径引入一些连接臂或者Linker然后再连接到蛋白质载体上，一般不能直接与其结构上的某个基团直接偶联，如果强行偶联势必改变抗原结构；所以通常是先借以合成中间体然后再制备完全抗原【ag-ab】。
5.金属离子抗原
金属离子的免疫抗原一般是借助于螯合剂来实现的，首先将螯合剂偶联到蛋白载体上，比如BSA和OVA，然后再将离子螯合上去；吉林大学的郝亚明依靠该技术成功制备出镉离子（Cd2+）单克隆抗体。
目前，制备金属离子单抗成功并不多，暨南大学的唐勇教授在这方面积累了很多，目前已经成功制备出汞离子（Hg2+）、镉离子（Cd2+）和铅离子（Pb2+）等单克隆抗体，在环境污染检测方面已开发出胶体金和ELISA试纸条等快速检测产品【ag-ab】。
6.组织、全细胞或细胞组分抗原
如果我们需要制备细胞或者细胞器表面抗原的抗体，我们需要用组织、全细胞或者全细胞器进行免疫，免疫的时候我们尽量用完整的细胞。采用组织、全细胞或者细胞器免疫动物必须将细胞分离出来，并且越纯越好，尽量洗净血清和细胞碎片等。采用此方法免疫的主要优点在于：细胞具有完整的颗粒性和外源性，更容易刺激机体免疫，对于目的抗原来说其形态更趋于真实结构。免疫途径为：腹腔注射，注射细胞剂量为1.0×105以上【ag-ab】。
对于细胞膜和细胞质作为抗原，提取方法一般是采用低渗溶液（低浓度的缓冲液加入MgCl2， MgCl2主要用于稳定细胞核使其不破碎）。如果单纯的提取细胞膜可以采用Ca2+匀浆离心法，离心后细胞膜沉淀下来；细胞器的提取主要是采用密度梯度离心法，对于密度非常相近的细胞器，需要更精确的密度梯度离心来实现，必要时可采用其他的辅助手段，具体案例具体分析【ag-ab】。
7.全病毒颗粒抗原
全病毒作为抗原制备高免血清，一般需要先进行灭活处理，灭活的基本原理就是破坏病毒表面的囊膜成分，使其失去感染细胞或机体的能力，至于灭活的方法这里就不赘述，感兴趣可查阅相关文献。病毒颗粒作为抗原，其纯度当然是越纯越好，最好是用糖梯度密度离心方法纯化，尽量避免里面含有细胞碎片成分和培养基成分，有条件的可以在电镜下确认病毒颗粒【ag-ab】。
8.细菌颗粒抗原
制备全细菌高免血清一般用于建立细菌凝集免疫学实验。所需细菌颗粒抗原尽量选择菌体状态良好（细菌表面及其附属物，如鞭毛保存完整）的。为了防止病源传播扩散，免疫前也需要灭活。免疫方法可以直接注射也可以与佐剂乳化之后再注射。用病原体（细菌或病毒）直接免疫制备的抗体效价一般不会太高，原因是机体面对病原体那么多种抗原/抗原表位要同时发挥免疫效应，每种抗原的剂量相对较少，确实让免疫系统有点力不从心【ag-ab】。
六、抗原免疫注意事项
1.纯度问题
作为抗原，其纯度越高抗体的下游制备工艺会越简单：对于多抗来说，高免血清中针对目抗原的抗体分子越多更容易得到效价高、背景更低的抗体；对于单抗制备来说，就更容易筛选到特异性高效价的抗体分泌细胞株【ag-ab】。
2.抗原毒性问题
作为抗原的物质，对动物机体毒性越小越好；毒性大，动物容易死亡或状态不好，很难产生出高品质抗体。科研人员为了制备蛇毒蛋白的单抗，采用体外细胞免疫法（也叫细胞刺激免疫法）：把脾脏B淋巴细胞取出体外培养，加入刀豆素刺激的同时加入抗原刺激B淋巴细胞致敏反应【ag-ab】。
3.抗原溶剂问题
抗原的溶剂一般选用PBS和生理盐水比较友好，但在抗原制备提纯的过程中不可避免的会引入一些去污剂【Triton，SDS或SKL（十二烷基肌氨酸钠）等】或其他有害化学试剂(如过量Tris等)。在免疫前这些物质不除去，动物免疫后会死亡，即使不死亡也会使动物机体受到剧烈刺激，免疫力严重下降。对于难溶蛋白（比如包涵体），可以溶解在低浓度尿素里面，因为动物可以耐受低浓度尿素，但是【ag-ab】并不推荐。
4.佐剂问题
佐剂的选择也是抗体制备方案中非常重要的环节，目前最主流的还是弗氏佐剂，由Freund最先研发出来，主要是用矿物油和糖类，弗氏佐剂又分不完全佐剂和完全佐剂：不完全佐剂里面加入卡介苗就是完全佐剂，用于初次调动机体免疫系统机能；弗氏佐剂主要是将水溶性的抗原物质包裹其中，形成一个抗原缓释仓库，源源不断刺激机体产生免疫反应【ag-ab】。
水溶性佐剂，改变传统佐剂的思维模式，通过佐剂内高分子组分物理性吸附抗原达到缓释目的，同时含有可快速刺激免疫细胞分裂成分，双重效果助力抗体效价快速提升。由于其水溶性，不需要乳化，只要混匀即可免疫，减少乳化过程中浪费，对于珍稀抗原特别适合，其抗原使用量只为弗氏佐剂的1/5；同时对抗原的结构更为友好，比较适合于制备针对抗原构象的抗体【ag-ab】。
抗原设计是抗体制备方案设计的核心，目前用于蛋白抗体制备的最常用的手段和方法是重组蛋白和多肽，而重组蛋白中最常用的是原核重组表达蛋白，因为其简单易操作，产量高，抗原表位暴露充分，蛋白性质稳定而倍受青睐【ag-ab】。
七、抗体纯化
不仅仅是抗体纯化问题，ag-ab以重组蛋白和多肽抗原设计及抗体制备、纯化、标记等实验以及科研利器为具体实例，具体阐述抗体制备的全过程;我们边走边聊。
